Científicos del Instituto de Investigación Scripps (TSRI) han hecho un gran avance en la comprensión de cómo los virus de la gripe se replican dentro de las células infectadas. Los investigadores utilizaron vanguardia biología molecular y técnicas de microscopía de electrones para «ver» uno de los complejos de proteínas esenciales de la gripe en un detalle sin precedentes. Las imágenes generadas en las proteínas estudio demuestran virus de la gripe en el acto de auto-replicación, poniendo de relieve las vulnerabilidades del virus que seguramente será de interés para los desarrolladores de drogas.
El informe, que aparece en línea en Science Express el 22 de noviembre de 2012, se centra en ribonucleoproteina de la gripe (RNP). RNPs contienen material genético del virus además de la enzima especial que el virus necesita para multiplicarse. «Estudios estructurales en esta área se había estancado debido a los obstáculos técnicos, por lo que este es un avance bienvenido», dijo Ian A. Wilson, el profesor Hansen de Biología Estructural en TSRI y autor principal del informe con TSRI Profesores de Biología Celular Bridget Carragher y Potter Clint. «Los datos de este estudio nos dan una imagen mucho más clara de la maquinaria de replicación del virus de la gripe».
En el núcleo de cualquier virus de la gripe se encuentran ocho RNPs, pequeñas máquinas moleculares que son vitales para la capacidad del virus para sobrevivir y extenderse en sus ejércitos. Cada RNP contiene un segmento-por lo general una proteína de codificación de un solo gen del genoma viral basada en ARN. Este segmento de ARN viral está recubierto con protección nucleoproteínas virales y tiene una estructura que se asemeja a un bucle de cadena de trenzado. Los extremos libres de este lazo trenzado están en manos de una enzima polimerasa del virus de la gripe, que maneja las dos tareas centrales de la reproducción viral: hacer nuevas RNA genómico viral, y hacer las transcripciones de ARN de genes-que se convertirán en nuevas proteínas virales. Aparte de su importancia en las infecciones comunes, la polimerasa de la gripe contiene algunas de las «barreras de las especies» clave que mantienen, por ejemplo, los virus de la gripe aviar de mamíferos infectantes. Las mutaciones en los puntos clave de la enzima han permitido al virus para infectar nuevas especies en el pasado. Así, los investigadores están ansiosos por conocer los detalles precisos de cómo la polimerasa de la gripe y el resto de la RNP interactuar.
Obtención de los detalles ha sido un verdadero reto. Una de las razones es que RNPs gripe son conjuntos complejos que son difíciles de producir de manera eficiente en el laboratorio. Genes de la gripe polimerasa son particularmente resistentes a ser expresado en células de prueba, y sus productos de la proteína existe en tres piezas separadas, o subunidades, que tienen que de alguna manera se auto-ensamblan. Hasta ahora, las RNPs gripe únicos que se han reproducido en el laboratorio se acortan las versiones cuyas estructuras no son exactamente los mismos que los de la gripe RNPs nativos. Los investigadores también están limitados en la cantidad de virus que pueden usar para este tipo de estudios. El equipo, sin embargo logrado desarrollar un sistema de expresión de células de prueba que produce todos los componentes de proteína y ARN necesarias para hacer de longitud completa RNPs gripe. «Hemos sido capaces de obtener las células para montar correctamente estos componentes a fin de que habíamos de trabajo, la auto-replicantes RNPs», dijo Robert N. Kirchdoerfer, autor principal del estudio. Kirchdoerfer era un estudiante de doctorado en el laboratorio de Wilson durante el estudio, y ahora es un investigador asociado postdoctoral en el laboratorio del Profesor TSRI Erica Ollmann Saphire. Kirchdoerfer finalmente purificada suficiente de estas RNPs contra la gripe para el análisis de microscopio electrónico automatizado TSRI del Grupo de Imagen Molecular, dirigido conjuntamente por Carragher y Potter.
Innovaciones del grupo de imágenes permiten a los investigadores analizar muestras moleculares con mayor facilidad y en menos tiempo, ya menudo con menos material de partida. «Hemos sido capaces, por ejemplo, para recopilar automáticamente datos durante varios días consecutivos, lo cual es inusual en el trabajo de microscopía electrónica», dijo Arne Moeller, un investigador asociado postdoctoral en el grupo de imágenes que fue el otro autor principal del estudio. Los microscopios electrónicos de alta resolución de hacer imágenes de sus objetivos pequeños golpeándolos con los electrones en lugar de fotones de luz. Las imágenes revelaron numerosos y bien definidos, complejos RNP. Para Moeller y la sorpresa de sus colegas, muchos de ellos parecían tener RNPs nuevas parciales que surgen de ellos. «Estaban ramificación, esto fue muy emocionante», dijo.
«Esencialmente se trataba de instantáneas de RNPs gripe están replicando, que nunca se había visto antes», dijo Kirchdoerfer. Estos y otros datos, construidos a partir de imágenes de decenas de miles de RNPs individuales, permitió al equipo para armar el modelo más completo hasta ahora para la gripe-RNP estructura y funciones. El modelo incluye detalles de cómo la polimerasa viral se une a su ARN, cómo se lleva a cabo la difícil tarea de transcripción de genes virales, y cómo una copia separada de la polimerasa viral ayuda a llevar a cabo la replicación del RNP. «Estamos ahora en condiciones de tomar una gran cantidad de lo que sabía antes sobre RNP virus de la gripe y asignarla a determinadas partes de la estructura RNP», dijo Kirchdoerfer.
El modelo de la gripe RNP nuevo pone de relieve algunos puntos débiles virales. Uno de ellos es un cambio de forma que una polimerasa de la subunidad que agarra ARN viral y la alimenta al sitio activo de la polimerasa en una segunda subunidad tiene que someterse durante la transcripción de genes virales. Otra es la interacción clave entre la polimerasa y nucleoproteínas virales. RNPs gripe son largas y flexibles, curvado y plegado en imágenes de microscopio de electrones, y por lo tanto el modelo estructural sigue siendo sólo ligeramente de grano fino. «No sería capaz de diseñar fármacos basados en este modelo solo», dijo Kirchdoerfer «, pero ahora tenemos una idea mucho mejor de cómo la gripe RNPs trabajo, y que sugiere algunas posibilidades para medicamentos contra la gripe mejores».
